Perfect Assembly Cloning Mix（5X） (无缝链接试剂盒-单片段)

Perfect Assembly Cloning Mix（5X）

(无缝链接试剂盒-单片段)

一、产品简介：

      传统克隆依赖于产物酶切并通过DNA连接酶的方法将单一目标片段连接至线性载体中，操作步骤多且耗时。新一代基因克隆技术是一项简单、高效、快速的DNA克隆技术，可将目标DNA片段定向克隆至任意载体的任意位点。目标线性化片段与载体两端15-25bp重叠区域的PCR片段定向重组，通过一步法地将1个片整合到一个载体中，完美快速实现定向无缝克隆。另外，该产品为母液5×，需要稀释成1×工作浓度。

二、无缝链接使用流程：

三、产品组成：

四、实验操作步骤：

1、引物设计流程：

特别说明：Revese序列为反向互补序列

2、反应体系：

*为了优化反应，每个反应管中需要线性载体20-150ng，PCR产物则为2倍含量

3、反应条件

将反应置于50℃，30min。而后则直接用于转化，或存放于-20℃。

4、转化

1)  将10μl连接产物加入到融冻的50-100μl感受态细胞中，用枪头吹匀，冰上静置30 min

2)  在42 ℃水浴锅热激60 s，迅速置于冰上冷却2 min。

3)  加入800μl 无抗生素的LB液体培养基，并在摇床37 ℃，200rpm，摇荡45 min。

4)  3000rpm，离心3分钟，而后去除培养基至剩余200μl。

5)  用枪头吹匀后涂板于的固体LB平板中，在37 ℃细菌培养箱中，培养12-16 h。

五、常见问题

1. 没有克隆或者较少克隆

答：1)较低转化效率，则建议使用转化效率较高感受态细胞；2）引物序列不对，则建议核对序列是否正确；3）不正确的DNA片段或者载体被使用，则建议核对插入片段和载体；4）连接产物与感受态比例不合适，则建议调整连接产物与感受态细胞比例为1：5-10。

2. 克隆中目标片段含量比例较低

答：1）载体酶切不彻底，则建议重新酶切并回收；2) LB平板放置太久或者抗生素失效；则建议重新制备LB平板并核对抗生素