RNA提取试剂盒
【产品介绍】
本试剂盒是用于提取培养细胞及动物组织、植物组织（植物幼嫩的叶、茎等）等 RNA的广谱型小量纯化试剂盒。试剂盒采用了独特的细胞裂解系统，无需苯酚氧仿抽提等步骤，简单快捷。组织或细胞通过匀浆裂解或液氮研磨后在裂解液中释放核酸，裂解液分别经过gDNA Eraser Spin Column(去除基因组DNA)以及RNA Spin Column(结合RNA)，从而达到提取高质量RNA的目的。
本试剂盒具有高效、快速、方便之特点，组织或细胞裂解后，提取操作仅需20分钟便可完成。利用该试剂盒提取的RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA污染。使用本试剂盒可从 1.0E+05~1.0E+07培养细胞、5～40 mg动物组织或50-100mg植物组织中纯化得到多至数十微克的高纯度RNA。提取得到的RNA 可以直接用于Northem杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real time RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
【产品组成】
名称 | 规格 | 温度 |
Buffer RL | 32 ml | 室温 |
Buffer RWD | 28 ml | 室温 |
Buffer RWC | 30 ml | 室温 |
RNase Free dH2O | 15 ml | 室温 |
gDNA Eraser Spin Column | 50 支 | 室温 |
RNA Spin Column | 50 套 | 室温 |
Collection Tube ( 2 ml ) | 50 支 | 室温 |
RNase Free Collection Tube (1.5ml) | 50 支 | 室温 |
说明书 | 一份 | |
注：含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理；首次使用前，向Buffer RWC中添加70 ml的100%乙醇。
【试剂盒之外所需准备试剂】
无水乙醇；70%乙醇(0.1% DEPC处理水配制)；PBS
【试剂使用前的注意事项】
1. Buffer RL 若出现沉淀，请于60℃加热溶解，待恢复至室温后使用。
2. 操作前请在 Buffer RL 中加入 50×DTT Solution 至终浓度为2%，即每1 ml 的 Buffer RL 中加入 20ul的50×DTT Solution。裂解 Buffer 最好现用现配。加入 50×DTT Solution 的 Buffer RL 可在室温放置1个月。
3. Buffer RWC在首次使用前，请添加70 ml的100%乙醇，混合均匀。
4. gDNA Eraser Spin Column 以及 RNA Spin Column 的最大容积为 600 μl，使用时如果液体的体积超出最大容积，请分批加入。
5. 预防RNase污染的注意事项：RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
6. 以下实验操作，如无特殊说明，均在室温进行。
Table 1. 不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量
样品数量 | 裂解Buffer RL推荐用量 |
贴壁培养细胞(培养四直径<6cm) | 350ul |
贴壁培养细胞(培养直径6-10cm） | 600ul |
<5×106的悬浮培养细胞 | 350ul |
5×106~1×107悬浮培养细胞 | 600ul |
5~20 mg普通动物组织（脑、肝脏等） | 350ul |
20~40 mg普通动物组织（脑、肝脏等） | 600ul |
5~20 mg特殊组织(肺、肾脏、脾等) | 350ul |
20~40 mg 特殊组织（肺、肾脏、脾等） | 600ul |
50~00 mg 植物组织（叶片、茎） | 500ul |
【操作方法】
动物培养细胞的 RNA 提取
一、细胞的裂解
悬浮培养的动物细胞裂解：
1. 悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，5000g, 离心2分钟，弃上清。
2. 使用1×PBS 清洗一次，5000g, 离心2分钟，弃上清；向收集的细胞中加入适当量(Table 1中推荐的使用量)的裂解BufferRL。
3. 使用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
贴壁培养细胞的裂解：
1. 吸去培养液，使用1×PBS清洗一次。
2. 向培养细胞中加入适当量的裂解 Buffer RL,水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。
3. 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
继上述各自步骤3
4、裂解液室温静量2分钟。
5、小心吸取裂解液到新的1.5mlRNase Free Tube 中。
注：对于基因组含量较多的材料或者材料起始量较大时，可以直接按步骤8进行(否则DNA含量过高可能造成gDNA Eraser Spin Column 域塞)，如基因组含量较低或材料起始量较少时，可以按步骤4-7进行。
6、将gDNA Eraser Spin Column 安放到2ml的Collection Tube上。
7、将裂解液转移入到gDNA Eraser Spin Column中。
8、12000rpm；离心1分钟。
9、弃gDNA Eraser Spin Column(进行基因组DNA提取时请保留)。保留2 ml Tube中的滤液。
10、向上述中加入与液体等体积的70%乙醇(此时可能会出现沉淀)，使用移液枪将溶液混合均匀。
11、立即将混合液（舍沉淀）全部转入到RNA Spin Column(含2 ml Collection Tube)中。(如果混合液的体积大于600ul，请分批加入，每次加入的体积不要大于600ul)
12、12000rpm，离心1分钟，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2 ml Collection Tube中。
13、将500ul的 Buffer RWD 加入至RNA Spin Column 中，12000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
14、将600ul的 Buffer RWC 加入至 RNA Spin Column 中，12000 rpm 高心30秒钟，弃滤液。注：请确认Buffer RWC中已经加入了指定体积的100%乙醇。请沿 RNA Spin Column 管壁四綱加入 Bulfer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
15、重复步骤14
16、将RNA Spin Column 重新安置于2ml Collection Tube 上，12000 rpm离心2分钟。
17、将RNA Spin Column安置于1.5ml的 RNase Free Collection Tube(试剂盒提供)上，在RNA Spin Column膜中央处加入50-200ul的RNase Free dH2O或0.1% DEPC处理水，室温静置5分钟。
18. 12000rpm离心2分钟洗脱RNA。
