Cell™ Counting Kit-8 试剂说明书

实验原理：

Cell Counting Kit-8 简称 CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等

WST-8 工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物

（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450mM 波长处测定 OD 值，间接反映活细胞数量。

试剂盒组成：

操作说明：

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

2、按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，通常做 3-5 个细胞浓度梯度，每个浓度建议 3-6 个复孔。

3、接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养 1-4h 后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间。）

【注】当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔(100μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔(100μL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK-8 溶液。

二. 细胞活性检测

1、在 96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃，5% CO2）。

2、向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，这会影响 OD 值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

4、用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

5、若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

三. 细胞增殖-毒性检测

1、在 96 孔板中配制 100 μL 的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养 24 小时（37℃，5% CO2）。

2、向培养板中加入 10 μL 不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 小时）。

4、向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

6、用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

7、若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

四.活力计算

细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（溶剂）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK-8        溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和 CCK-8  溶液而没有细胞的孔的吸光度A（溶剂）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

五.注意事项

1. 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

2. 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入 CCK-8 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰 OD 值读数。

3. 白细胞可能需要培养较长时间。

4. 如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。

5. 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，不会对检测造成影响。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7. 无特殊毒性，按普通化学品处理。如果不慎与眼、皮肤和衣物接触，请立刻用大量清水冲洗，情况严重者请及时就医。

六.保存条件

4℃干燥避光保存，有效期一年。-20℃干燥避光保存，有效期